PCR 退火溫度計算器
輸入較不穩定引物的熔解溫度 Tm 與模板 Tm，即時算出最佳退火溫度 Ta*，並提供 Tm−5 的簡易起始參考。
輸入資料
計算結果
重點速覽：退火溫度（annealing temperature，Ta）是 PCR 循環中引物與模板結合（黏合）的步驟溫度，直接影響擴增的特異性與效率：太高引物結合不上、太低則易產生非專一產物。常用的經驗公式為 Ta* = 0.3×Tmᵖ + 0.7×Tmᵗ − 14.9（°C），其中 Tmᵖ 為較不穩定引物的熔解溫度、Tmᵗ 為模板（產物）的熔解溫度。另一簡易起始法是 Ta = Tmᵖ − 5。
計算公式
最佳退火溫度：Ta* = 0.3 × Tmᵖ + 0.7 × Tmᵗ − 14.9（°C）。
簡易起始法：Ta = Tmᵖ − 5（Tmᵖ 為較不穩定引物）。
Tmᵖ 取兩支引物中 Tm 較低者。
$$T_a^{*} = 0.3\,T_m^{p} + 0.7\,T_m^{t} - 14.9$$$$T_a = T_m^{p} - 5$$使用說明
- 由引物設計軟體取得兩支引物的 Tm，填入較低（較不穩定）的一支。
- 填入模板／目標產物的熔解溫度 Tmᵗ。
- 右側即時顯示最佳退火溫度 Ta* 與簡易法 Ta，作為 PCR 條件設定的起點。
退火溫度設定原則
| 情況 | 調整方向 | 說明 |
|---|---|---|
| 出現非專一產物 | 提高 Ta | 增加結合嚴謹度，減少錯誤引物結合 |
| 完全無產物 | 降低 Ta | 放寬結合條件，提升引物黏合機會 |
| 引物 Tm 差異大 | 取較低 Tmᵖ | 以較不穩定引物為準，避免其結合不上 |
| 優化條件 | 梯度 PCR | 以 Ta 為中心 ±5°C 做溫度梯度找最佳點 |
本公式為經驗估算，最終退火溫度應以梯度 PCR 實測校正。
理財情境案例
標準 PCR 條件設定
引物設計軟體給出較不穩定引物 Tmᵖ = 65.5°C、目標產物 Tmᵗ = 88.6°C。
Ta* = 0.3 × 65.5 + 0.7 × 88.6 − 14.9 = 19.65 + 62.02 − 14.9 ≈ 66.77°C。
以約 67°C 作退火溫度的起點，若出現雜帶再上調、無產物則下調。
簡易法快速估算
手邊只有引物 Tm 時，可用簡易法：Tmᵖ = 60°C → Ta = 60 − 5 = 55°C。
若同時知道模板 Tmᵗ = 85°C，經驗公式 Ta* = 0.3×60 + 0.7×85 − 14.9 = 62.6°C。
兩者相差約 7°C，故建議以梯度 PCR（如 55–63°C）實測，取產量最高且最專一者。
常見問題
為什麼要用「較不穩定」（Tm 較低）的引物？
兩支引物必須在同一溫度下都能結合上模板。若以 Tm 較高的引物為準設定退火溫度，Tm 較低的那支可能結合不上，導致單邊擴增或失敗。取較低 Tm 的引物可確保兩支都能有效黏合。
退火溫度太高或太低會怎樣？
太高會使引物難以結合，導致產量下降甚至無產物；太低則結合條件太寬鬆，引物可能錯配到非目標序列，產生非專一產物（雜帶）或引物二聚體。理想的 Ta 要在特異性與產量間取得平衡。
Tm 從哪裡取得？
Tm（熔解溫度）通常由引物設計軟體（如 Primer3、OligoCalc）或引物合成商提供的規格表算出，這些工具會用最近鄰熱力學模型並考慮鹽濃度。本計算器直接使用你提供的 Tm 值。
算出來的 Ta 就是最終條件嗎？
不是，它只是起點。因為 Tm 計算會隨演算法與緩衝液條件而異，實務上建議做梯度 PCR：以算得的 Ta 為中心，上下各設幾度（如 ±5°C）的溫度梯度，實測後選產量最高且最專一的溫度。
簡易法 Tmᵖ − 5 和經驗公式該用哪個？
只有引物 Tm 時可用 Tmᵖ − 5 快速估算；若同時知道模板 Tm，加權公式 Ta* = 0.3Tmᵖ + 0.7Tmᵗ − 14.9 通常更貼近最佳條件。兩者都是經驗值，最終仍以梯度 PCR 校正為準。
相關工具
參考資料
內容審核：香港計算器科學團隊。退火溫度經驗公式與 PCR 條件優化原則參考標準分子生物學實驗手冊。