引物 Tm 計算器
輸入引物中 A、T、G、C 四種鹼基數目，即時算出 Wallace 規則與鹽校正 GC 法的熔解溫度 Tm，適用於 PCR 引物設計。
輸入資料
計算結果
重點速覽：引物熔解溫度（primer melting temperature, Tm）是一半引物與模板解離（雙鏈變為單鏈）時的溫度，是 PCR 設定退火溫度的關鍵。對短引物（< 14 nt），常用 Wallace 規則：Tm = 4×(G+C) + 2×(A+T)；對較長引物，可用考慮鹽濃度的 GC 法：Tm = 81.5 + 0.41×%GC − 675÷長度（約 50 mM Na⁺）。退火溫度通常設在較低引物 Tm 減約 5 °C。
計算公式
Wallace 規則（短引物）：Tm = 4 × (G + C) + 2 × (A + T)。
鹽校正 GC 法：Tm = 81.5 + 0.41 × %GC − 675 ÷ 長度。
退火溫度參考：Ta ≈ 較低引物 Tm − 5 °C。
$$T_m = 4(G + C) + 2(A + T)$$$$T_m = 81.5 + 0.41 \times \%GC - \dfrac{675}{L}$$使用說明
- 數出引物序列中 A、T、G、C 各自的鹼基數目並填入。
- 系統同時顯示 Wallace 規則與鹽校正 GC 法的 Tm 與引物長度。
- 短引物（< 14 nt）參考 Wallace，較長引物參考 GC 法。
常見引物組成對應 Tm（Wallace 規則）
| 組成 | 長度（nt） | Wallace Tm（°C） |
|---|---|---|
| A3 T3 G3 C3 | 12 | 36 |
| A2 T2 G4 C4 | 12 | 40 |
| A5 T5 G5 C5 | 20 | 60 |
| A4 T4 G6 C6 | 20 | 64 |
Wallace 規則簡單但只適合 < 14 nt 的短引物；較長引物用它會高估 Tm，應改用鹽校正 GC 法或最近鄰模型。
理財情境案例
短引物 Wallace 估算
一支 12 nt 引物含 A3、T3、G3、C3。
Wallace Tm = 4×(3+3) + 2×(3+3) = 24 + 12 = 36 °C。
屬短引物，退火溫度可設約 31 °C 起試，再依擴增專一性微調。
較長引物 GC 法
一支 20 nt 引物含 A5、T5、G5、C5，GC 含量 50%。
GC 法 Tm = 81.5 + 0.41×50 − 675÷20 = 81.5 + 20.5 − 33.75 ≈ 68.25 °C。
退火溫度可設約 63 °C，較 Wallace 規則（此例 60 °C）更貼近長引物實況。
常見問題
Wallace 規則和 GC 法該用哪個？
Wallace 規則（4×GC + 2×AT）只適合約 14 nt 以下的短引物或寡核苷酸；超過此長度會系統性高估 Tm。較長引物請用鹽校正 GC 法，或更精確的最近鄰（nearest-neighbor）熱力學模型。本計算器同時給出兩者供對照。
退火溫度要怎麼由 Tm 決定？
常見經驗法是取一對引物中較低的 Tm 再減約 5 °C 作為退火溫度起點。實務上可做梯度 PCR 在 Tm−5 上下數度掃描，找出擴增專一且產量高的溫度。GC 豐富模板可能需要更高退火溫度或添加 DMSO。
為什麼一對引物 Tm 要接近？
正向與反向引物 Tm 差異過大（一般建議 < 5 °C），會使兩者在同一退火溫度下結合效率不均，導致擴增偏差或非專一產物。設計時應調整引物長度與 GC 含量，使兩支 Tm 儘量接近。
鹽濃度與引物濃度會影響 Tm 嗎？
會。較高的一價陽離子（如 Na⁺、K⁺）與 Mg²⁺ 濃度會屏蔽磷酸骨架負電、穩定雙鏈而提高 Tm；引物濃度也略有影響。本計算器的 GC 法內含約 50 mM Na⁺ 的校正，精確計算需採納入這些變數的模型。
GC 含量對 Tm 影響有多大？
很大。因 G–C 有三個氫鍵、A–T 只有兩個，GC 含量越高 Tm 越高。在 Wallace 規則中，每個 G/C 貢獻 4 °C、每個 A/T 只 2 °C；在 GC 法中，每提高 1% GC 約增 0.41 °C。
相關工具
參考資料
內容審核：香港計算器科學團隊。Wallace 規則與鹽校正 GC 法 Tm 公式參考標準 PCR 實驗手冊。